A la 01:23:04 comenzó el experimento. Cuatro de las bombas de circulación principales (BCP) estaban activadas; durante el funcionamiento normal, seis de las ocho suelen estar activadas. Se cortó la entrada de vapor a las turbinas, dejando que estas funcionasen por inercia. Los generadores diésel arrancaron y tendrían que haber cubierto la demanda de energía de las BCP para la 01:23:43. Mientras tanto, la alimentación de las BCP debía ser suministrada por el generador de la turbina. A medida que disminuía el impulso del generador de la turbina, sin embargo, también lo hizo la electricidad dirigida a las bombas. La reducción del caudal de agua dio lugar al aumento de la formación de huecos de vapor (burbujas) en el núcleo.
Debido al coeficiente de vacío positivo del reactor RBMK a niveles bajos de potencia del reactor, este entró en un bucle de retroalimentación positiva, en el que la formación de huecos de vapor reduce la capacidad del agua de refrigeración líquida para absorber neutrones, lo que a su vez incrementa la potencia del reactor. Esto causó que aún más agua se convirtiera en vapor, produciendo un aumento de potencia adicional. Durante casi todo el experimento, el sistema de control automático contrarrestó con éxito esta retroalimentación positiva, insertando continuamente barras de control en el núcleo para limitar el aumento de potencia. Sin embargo, este sistema tenía el control de sólo 12 barras, y casi todas las demás habían sido retraídas manualmente. Con los sistemas de emergencia desconectados, el reactor experimentó una subida de potencia tan extremadamente rápida que los operadores no lograron detectarla a tiempo.
A la 01:23:40, la computadora SKALA registró el inicio de un SCRAM (apagado de emergencia) del reactor, que desencadenaría involuntariamente la explosión. El SCRAM comenzaba al pulsar el botón AZ-5. Este activaba el mecanismo de accionamiento en todas las barras de control para insertarlas en el núcleo por completo, incluyendo las barras de control manuales que habían sido retiradas imprudentemente antes. La razón por la que se pulsó el botón AZ-5 no se conoce, fuese esta una medida de emergencia en respuesta al aumento de la temperatura o simplemente un método rutinario de apagar el reactor una vez finalizado el experimento.
Existe la opinión de que el SCRAM pudo haber sido ordenado como respuesta al rápido e inesperado aumento de potencia, aunque no hay datos documentados que lo demuestren. Algunos han sugerido que el botón nunca fue pulsado, sino que la señal se produjo automáticamente por el sistema de protección de emergencia (SPE); sin embargo, SKALA registró una señal claramente manual. A pesar de ello, la cuestión de cuándo o incluso de si realmente se presionó o no el AZ-5 ha sido objeto de debate. Hay afirmaciones de que la presión fue causada por la rápida aceleración de energía al comienzo, y acusaciones de que el botón no fue pulsado hasta que el reactor empezó a autodestruirse. Sin embargo, otros afirman que esto había ocurrido antes y en condiciones de calma.
Tras presionar el botón AZ-5, comenzó la inserción de las barras de control en el núcleo del reactor. El mecanismo de inserción mueve las barras a 0,4 m/s, de modo que tardarían entre 18 y 20 segundos en recorrer los 7 m altura del núcleo. Un problema mayor era que estas tenían una punta de grafito, lo que inicialmente desplazaba el refrigerante absorbente de neutrones antes de introducir el material de boro absorbente de neutrones para frenar la reacción. Como resultado, el SCRAM aumentó la velocidad de reacción en la mitad superior del núcleo.
Al entrar el grafito en contacto con el núcleo, se produjo un pico masivo de energía y el núcleo se sobrecalentó, causando que algunas de las barras se resquebrajaran cuando estas se habían insertado unos 2,5 m. Al cabo de tres segundos, el nivel de potencia se elevó por encima de los 530 MW. De acuerdo con algunas estimaciones, la potencia del reactor aumentó a alrededor de 30 000 MW, diez veces la producción normal; la última lectura en el panel de control fue de 33 000 MW.
Se oyeron fuertes ruidos y entonces se produjo una explosión causada por la formación de una nube de hidrógeno dentro del núcleo, que hizo volar la tapa 2000 t del reactor, provocando un incendio en la planta y una gigantesca emisión de productos de fisión a la atmósfera.
Los observadores que se encontraban en el exterior del bloque 4 vieron bultos incendiados y chispas saliendo eyectados del reactor, algunos de ellos cayendo sobre el techo de la sala de máquinas y provocando un incendio. Fue expulsado alrededor del 25% del grafito al rojo vivo y demás material recalentado de los canales de combustible. Las partes de los bloques de grafito y canales de combustible estaban fuera del edificio del reactor. Como resultado del daño a la construcción, la alta temperatura del núcleo creó un flujo de aire a través del mismo, y el aire caliente encendió el grafito.
Minutos después del accidente, todos los bomberos militares asignados a la central ya estaban en camino y preparados para controlar el desastre rápidamente. Las llamas afectaban a varios pisos del reactor 4 y se acercaban peligrosamente al edificio donde se encontraba el reactor 3. El comportamiento heroico de los bomberos durante las tres primeras horas del accidente evitó que el fuego se extendiera al resto de la central. Aun así, pidieron ayuda a los bomberos de Kiev debido a la magnitud de la catástrofe.
Contrario a las regulaciones de seguridad, se había utilizado bitumen —un material combustible— en la construcción del techo del edificio del reactor y de turbinas. El material eyectado provocó al menos cinco incendios distintos en el techo del reactor 3, que aún seguía en funcionamiento. Era imperativo extinguirlos y proteger los sistemas de refrigeración. El jefe del turno nocturno, Yuri Bagdasarov, quiso apagar el reactor, pero el ingeniero en jefe, Nikolai Fomin, no se lo permitió. Se les dieron a los operadores máscaras de gas y tabletas de yoduro de potasio, y se les ordenó seguir trabajando. A las 05:00, Bagdasarov decidió por sí mismo apagar el reactor, dejando solo a quienes operaban los sistemas de refrigeración de emergencia. Los reactores 1 y 2 fueron apagados y puestos en refrigeración de emergencia a la 01:13 y 02:13 del 27 de abril, respectivamente. Dos días después, había 18 heridos muy graves y 156 heridos con lesiones de consideración producidas por la radiación. Todavía no había una cifra del número de muertos, pero en un accidente nuclear aumenta día tras día la lista de víctimas, hasta pasados muchos años.
Los niveles de radiación en las zonas más afectadas del edificio del reactor se estimaron en 5,6 röntgens por segundo, lo que equivale a más de 20 000 röntgens por hora. Una dosis letal es de alrededor de 100 röntgens por hora, por lo que en algunas zonas los trabajadores que no tenían protección adecuada recibieron dosis mortales en menos de un minuto.
Sin embargo, un dosímetro capaz de medir hasta 1000 R/s quedó enterrado en los escombros cuando se derrumbó una parte del edificio, y otro se quemó al encenderlo. Todos los dosímetros restantes tenían límites de 3,6 R/h, por lo que la aguja quedaba atascada en el nivel máximo. En consecuencia, los operarios del reactor solo podían determinar que el nivel de radiación estaba en algún lugar por encima de los 3,6 R/h, cuando en ciertas áreas llegaban a los 30 000 R/h. Debido a las bajas e inexactas lecturas, el jefe del turno nocturno, Alexander Akimov, supuso que el reactor estaba intacto.
Se ignoró la evidencia de piezas de grafito y combustible del reactor alrededor del edificio, y las lecturas de otro dosímetro traído hacia las 04:30 de la mañana fueron desestimadas bajo el supuesto de que estaba defectuoso. Akimov se quedó con los demás operadores en el edificio del reactor hasta la mañana tratando de bombear agua al reactor. Ninguno de ellos llevaba equipo de protección. La mayoría, incluyendo Akimov, murieron por envenenamiento por radiación dentro de las tres siguientes semanas.
El primer acercamiento en helicóptero evidenció la magnitud de lo ocurrido. En el núcleo, expuesto a la atmósfera, el grafito del mismo ardía al rojo vivo, mientras que el combustible y otros metales se habían convertido en una masa líquida incandescente. La temperatura alcanzaba los 2500 °C, e impulsaba el humo radiactivo en un efecto chimenea a una altura considerable.
Mientras tanto, se estableció el control permanente de la radiación en Prípiat, que para la tarde del 26 de abril era de unas 600 000 veces el fondo natural. Por otro lado, en la base de la planta se registró un astronómico nivel de 2080 röntgens; un ser humano tardaría quince minutos en absorber la dosis letal.